HPLC法测定风热咳嗽丸中黄芩苷的含量
摘 要
目的:建立风热咳嗽丸中黄芩苷的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为依利特Hypersil ODS柱E2623722(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为甲醇-水-磷酸（42：58：0.2），检测波长为280nm，柱温30℃，流速为1ml/min，进样体积为对照品10μl，样品20μl。结果：样品处理方法考察表明黄芩苷在回流时间为3小时时测定含量为最佳。黄芩苷在0.002-0.01597mg/ml 的浓度范围内与峰面积线性关系良好，以峰面积(y)为纵坐标,黄芩苷质量浓度（x）为横坐标进行线性回归，得回归方程为y=4×107x-18356，（r=0.9996）。稳定性考察表明风热咳嗽丸室温放置24小时，其中黄芩苷含量稳定。精密度，重复性试验的RSD<2%；耐用性良好。平均回收率为98.92%。三批风热咳嗽丸样品的含量分别为1.863mg/g；1.843mg/g；1.806mg/g。结论：该方法操作简便，专属性，稳定性，重复性，准确度好，可用于风热咳嗽丸中黄芩苷的含量测定[1]。
关键词：高效液相色谱法；风热咳嗽丸；黄芩苷；含量测定
Abstract
Objective: To establish a method for the determination of baicalin in Fengre kesou pills. Methods: An HPLC method was adopted. An Hypersil ODS column E2623722(4.6 mm * 250 mm, 5 microns) was used at temperature (25℃) and mobile phase of methanol - water - phosphate (42:58:0.2) with a flow rate of 1mL/min.The detection wavelength was 280 nm and the sample volume reference substance 10 μl, 20 μl samples. Results: the sample processing method investigation showed that 3 hours for determination of baicalin in reflux time content for the best. Baicalin was linear in the range of 0.002-0.01597 mg/mL with the equation of y=4×107x-18356，（r=0.9996）. Fengre kesou pills was stable in 24 hours after preparation..RSDs of precision ,reproducibility tests were lower than 2%,The durability was good..The average recovery was 98.92%. The content of three groups of Fengre kesou pills samples were 1.863 mg/g; 1.843 mg/g; 1.806 mg/g. Conclusion: the method is simple, specific, stable, reproducible and accurate ,which can be used for the determination of baicalin in Fengre kesou pills[1].
Key words: HPLC；Fengre kesou pills；Baicalin；Assay determination
1 绪论
风热咳嗽丸的处方中包括黄芩、枇杷叶、连翘、薄荷、菊花、苦杏仁霜、桔梗、桑叶、浙贝母等中药材，这些中药材经过特定的制剂制备工艺制成的中药制剂，在药理作用上具有祛风解热，止咳化痰等作用。医学临床上常用于风热咳嗽，鼻流稠涕，头晕发热，口干舌燥等症状的治疗。
黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)属于双子叶唇形科植物，而黄芩苷（baicalin）则是从其干燥的根中提取分离出来的一种黄酮类化合物,该化合物常温下为淡黄色粉末，味道略苦。黄芩苷难溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，微溶于氯仿和硝基苯，几乎不溶于水，可溶于热乙酸。当遇到三氯化铁时显绿色，遇到乙酸铅时产生化学反应生成橙色的沉淀。溶于碱及氨水,最开始显示黄色，随之则变为黑棕色。黄芩苷在药理作用中具有显著的生物活性，还具有抑制细菌生、缓解哮喘、泻火解毒、止血、安胎、通肠利尿、抗炎症、可以降低胆固醇、抗血栓的形成、安胎、抗变态反应及解痉作用，也可以作为哺乳动物的肝脏涎酶的特异性抑制剂，具有调节某些疾病的作用，也具有较强的抗癌反应生理效能[2]。黄芩是多年的生草本植物，在一般情况下家种黄芩2年即可收获可供药用。适宜于中性或偏碱性、土质疏松、肥沃土壤生长，忌连作。喜温和气候，喜光，耐旱、耐寒、怕涝、怕积水。由于黄芩药材资源的分布较广，以前多为野生，在北方各省均有分布，所以随着用量得增大和无序采挖，野生产量逐渐不能满足市场需要；二十世纪九十年代开始，家种黄芩得种植逐步开展，逐步形成山东、山西、陕西、甘肃四大产区[3]。春秋两季均可采挖，但一般集中在秋季的10月中旬采挖。
黄芩在临床上的应用历史久远，已达2000多年的历史。现在仍然是治疗清热燥湿、泻火解毒等临床症状的要药。除中医中处方药以外，还被大量用作中成药的原料药材。很多地区利用黄芩或黄花黄芩来提取黄芩素、黄芩甙作为制药原料，用量也很大，就顺其自然的成为一条新的中药制剂的开发途径。近年来随着国际上对黄芩苷研究的持续升温以及认识的逐步深入,认为黄芩苷在清除氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、调节免疫以及促进细胞凋亡等多方面均有作用，已有研究证实黄芩体内外具有抗肿瘤和HIV等有关作用和对其相关作用机制的研究，但对其有效成分抗肿瘤作用未见报道[4]。国外材料报导，黄芩酊剂，可治植物神经的动脉硬化性的高血压以及神经性的机能障碍；也可消除高血压引起的头痛、失眠、胸闷等症。随着目前黄芩的应用的不断扩大，国内外对其临床应用的不断重视和研究，使得黄芩苷具有很大的开发利用前途和价值。
黄芩作为风热咳嗽丸的主要成分之一。许多含有黄芩的中药制剂均采用黄芩苷作为其质量控制指标，但对其含量测定方法的研究，国内外都有很多研究但是研究方法各异,比如：高效液相色谱法、毛细管电泳法、紫外分光光度法、薄层扫描法、紫外分光光度法和液相色谱-串联质谱法等；且每种方法各有其适用范围和优缺点,尤其是近年来国内外关于黄芩苷含量测定新方法的建立可以极大降低检测限,为黄芩苷的体内分析和药动学研究奠定了基础[5]。本课题针对3个不同批号的风热咳嗽丸，用HPLC法分别测定了其中黄芩苷的含量。首先，探究了出了测定该中药制剂中黄芩苷的含量的最佳处理方法，然后做了该测定方法的方法学验证试验，试验证明该方法操作简便，专属性，稳定性，重复性，准确度好，满足实验要求，可用于风热咳嗽丸中黄芩苷的含量测定。
2 仪器与材料
4 结论
本文采用的是高效液相色谱法对风热咳嗽丸中黄芩苷的含量测定，方法简单、重复性好。风热咳嗽丸中辅料对测定无干扰，峰形对称、加样回收率符合分析测定的要求，结果准确可靠，可用于风热咳嗽丸中黄芩苷含量的测定。
试验开始阶段对黄芩苷对照品进行了紫外全波段扫描，结果显示黄芩苷在276nm和316nm处有最大吸收，且276nm处吸收峰强度大于316nm，两个吸收峰间的吸收谷值在299nm处，因而测定黄芩苷含量时可根据需要在276nm和316nm附件选择检测波长。本实验选取的是280nm为测定波长。
测定风热咳嗽丸样品中黄芩苷含量，前提就是样品处理方法是否适合，所以本实验最开始就对风热咳嗽丸的样品处理方法进行了考察。从改变提取方式（浸泡过夜、超声、回流）、改变提取溶剂（甲醇、70%甲醇、95%乙醇、70%乙醇）、改变提取时间（1h、2h、3h、4h）这三个方面进行了全面的比较，最终确定70%乙醇，水浴加热回流3h为最优样品处理方法。
由于黄芩苷本身的结构是呈弱极性，所以在其含量测定方法的选择上用的是HPLC法，常用固定相为C18键合相，流动相通常以水为基础溶剂，加入一定量甲醇或者乙腈为有机相。乙腈虽然是HPLC的流动相的重要选择之一，但由于色谱纯的乙腈成本高，而且相对较大的毒性也是乙腈的一个缺点。所以相比之下，本实验就选择了以色谱甲醇为主的流动相。试验前期我们还考察了当甲醇-水体积比为42:58和43:57时对色谱峰的影响，结果表明拖尾现象随甲醇比例的增加而减少，所以选用了甲醇-水体积比为42:58为流动相。除此之外，流动相的PH对黄芩苷的色谱峰峰形有一定影响，由于黄芩苷具有酚羟基而呈弱酸性，其PKa值为5.047，难溶于水和稀酸溶液，易溶于稀碱溶液，黄芩苷水溶液在酸性条件下稳定性较好，在碱性条件下极不稳定。因此，为了抑制黄芩苷的解离，通常在流动相中加入少量酸以改善峰形，所以加入了体积比为0.2个比例的磷酸。最后参照2015版《中华人民共和国药典》选定了风热咳嗽丸中黄芩苷的最适色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-磷酸（42：58：0.2）为流动相；检测波长为280nm，柱温30℃，流速为1ml/min。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。该方法整体改善了色谱条件，不仅经济实惠，而且分析时间显著缩短，使得分析方便快捷，并有利于资源的节约和试验效率的提高。最后又对该含量测定的方法学实验进行了考察，结果表明该方法操作简便，专属性，稳定性，重复性，准确度好，可用于风热咳嗽丸中黄芩苷的含量测定。
风热咳嗽丸作为中药制剂，其处方中的中药材原料药成分都是原生药入药，不同地区、不同气候、不同的种植规划技术、不同的用药部位等都会影响药材的质量，所以在各药材质量的选择上会很大影响中药制剂成品中各成分的含量。黄芩药材的选择会影响最终测得风热咳嗽丸中黄芩苷的含量以及最终的药理作用。目前黄芩苷及其有效成分黄酮类化合物具有广泛的药理活性，目前从黄芩中已发现41种黄酮类化合物，其中以黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量最高，且药理作用最为明显[15]。在部分论文和资料记载的对含黄芩药材的制剂标准中，大部分都是以黄芩苷这一种成分作为其制剂质量考察指标，但缺少对黄芩药材中的以黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素为代表的总黄酮进行的研究。若以黄芩总黄酮含量作为制剂质量评价指标的话则更具说服力。
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http://www.bysj360.com/html/6302.html
