低共熔溶剂中脂肪酶催化脂化反应的研究
摘要
低共熔溶剂是基于生物领域中细胞内细胞质组分分析和化学领域中低共熔溶剂概念的思考，提出的由生物体内小分子代谢物如胆碱衍生物、醇类、糖类、尿素等物质作为组分形成的新型溶剂。鉴于这种新型溶剂可能在自然界的广泛存在和介质功能，其作为工业催化反应介质，将有助于解决目前酶催化在工业上因环境不匹配带来的应用瓶颈，可能为生物催化反应提供一个真正合适的介质环境。
本文工作主要为探索将这些天然来源的一些小分子物质形成的溶剂引入到生物催化反应中，考察这些天然低共熔溶剂的基本性质和脂肪酶在此溶剂中的表现，并初步评估了脂肪酶在这种新型溶剂和新型反应体系中进行油脂催化转化的效率和可能形式。
主要研究内容为以下方面：一、仪器分析研究了低共熔溶剂基本理化性质，综合采用 13C NMR、1HNMR、FT-IR、DSC/TG 测试了这些溶剂的分子结构，并探讨了组分之间形成和相互作用机制。考察了水分添加对溶剂化学结构、物理性质以及与生物大分子相互作用的影响。结果发现，溶剂是组分之间主要通过氢键相互作用形成的常温下为液体的混合物；一定量的水分添加能减少溶剂内部氢键相互作用，并显著降低溶剂黏度。因此可以通过控制水分来达到提高溶剂应用效果的目的。研究初步探明了溶剂的形成机制和化学特性，并评估了水分对溶剂在应用上的可能影响。二、评估了脂肪酶在天然低共熔溶剂中的稳定性和底物选择性。结果发现，不同溶剂对脂肪酶的影响差异很大，含有机酸的溶剂可以抑制脂肪酶的活性，而在含有“渗透质”如甜菜碱、木糖醇、海藻糖等组分的溶剂中，脂肪酶能维持跟在水中相似甚至更高的活性。溶剂可以显著提高酶的热稳定性，CALB 脂肪酶在甜菜碱-甘油、氯化胆碱-海藻糖和甜菜碱-木糖醇溶剂中 80℃保温 2 h，酶活没有明显降低。天然低共熔溶剂对脂肪酶的脂肪酸选择性有明显的影响，尤其是对短链底物的选择性。脂肪TL100 在天然低共熔溶剂中对 C4 底物的选择性相对于在水中明显降低。而对于 CALA脂肪酶，天然低共熔溶剂的加入可提高酶对 C6 底物的选择性。三、考察了低共熔溶剂中的酯化反应特性，通过合成两种营养功能产品 1,3-甘油二酯和 n-3 PUFA 甘油三酯验证了溶剂作为酶催化反应介质的优势。天然低共熔溶剂的存在可以改变脂肪酶催化反应过程中的底物选择性。1）氯化胆碱的存在有利于甘油酯化反应中甘油二酯尤其是 1,3-甘油二酯的积累。在含氯化胆碱的溶剂体系中，脂肪酶 Novozym 435 催化酯化反应 1 h 即可获得 42.9%的 1,3-甘油二酯（56.7 wt%）。2）溶剂的存在，尤其是尿素组分的存在有利于酯化反应中甘油三酯的积累。在氯化胆碱-尿素（1:1）溶剂体系中，脂肪酶 Novozym 435 催化酯化 55℃条件下反应 12 h，n-3PUFA 甘油三酯含量达到 55.03 wt%。
关键词：低共熔溶剂；脂肪酶；生物催化；甘油酯
目录
第一章 绪论 5
第二章 低共熔溶剂的制备及基本性质 14
2.1 材料与仪器 14
2.1.1 主要材料与试剂 14
2.1.2 主要仪器和设备 14
2.2 实验方法 15
2.2.1 低共熔溶剂的制备 15
2.2.2 FT-IR 和 NMR 测定 15
2.2.3 热力学性质分析 15
2.2.4 物理性质测定 16
2.2.5 圆二色谱测定 16
2.3 结果与讨论 16
2.3.1 低共熔溶剂的制备 16
2.3.2 低共熔溶剂表征 17
第三章 低共熔溶剂中脂肪酶稳定性评估 23
3.1 材料与仪器 23
3.1.1 主要材料与试剂 23
3.1.2 主要仪器和设备 24
3.2 实验方法 24
3.2.1 CALB 商品化酶纯化步骤 24
3.2.2 脂肪酶酶活检测 24
3.2.3 不同脂肪酶在天然低共熔溶剂中酶活测定 24
3.2.4 温度对脂肪酶稳定性的影响 24
3.2.5 含水量对脂肪酶稳定性的影响 25
3.2.6 脂肪酶选择性测试 25
3.3 结果与讨论 25
3.3.1 不同低共熔溶剂对脂肪酶酶活的影响 25
3.3.2 不同温度的影响 28
3.3.4 低共熔溶剂对脂肪酶选择性的影响 31
第四章 低共熔溶剂中脂肪酶催化酯化选择性评估 33
4.1 材料与仪器 33
4.1.1 主要材料与试剂 33
4.1.2 主要仪器和设备 34
4.2 实验方法 34
4.2.1 低共熔溶剂的制备 34
4.2.2 脂肪酶催化油酸甘油酯化 34
4.2.3 甘油酯组成检测 34
4.3 结果与讨论 34
4.3.1 脂肪酶的催化表现 34
4.3.2 水分含量对酯化选择性的影响 35
4.3.3 溶剂和反应时间对酯化选择性的影响 38
4.3.4 氯化胆碱含量对酯化选择性的影响 38
4.3.5 基于酯化选择性的 1,3-甘油二酯合成 39
第五章 低共熔溶剂中脂肪酶催化酯化合成甘油酯 44
5.1 材料与仪器 44
5.1.1 主要材料与试剂 44
5.2 实验方法 45
5.2.1 低共熔溶剂的制备 45
5.2.2 鱼油脂肪酸的制备 45
5.2.3 脂肪酶催化酯化反应 45
5.2.4 甘油酯组成检测 45
5.2.5 脂肪酸组成分析 46
5.3 结果与讨论 46
5.3.1 天然低共熔溶剂体系中酯化反应 46
5.3.2 低共熔溶剂组分比例的影响 51
5.3.4 反应温度的影响 52
结论 56
参考文献 57
参考文献
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