医学检验论文代写小儿支原体肺炎医学检验研究
研究背景：1）说明本研究的目的与意义
2）综述国内外有关本研究的研究现状和自己的见解
一．研究的目的与意义
肺炎支原体肺炎MPP作为儿科常见病、多发病，在世界范围内广泛分布，表现为流行及间歇时间长、缓慢播散、可持续数月等特点，目前已引起临床很大重视[1]。然而MPP的致病机制比较复杂, 包括直接、间接及免疫反应等多种机制。且与宿主的年龄、性别、营养、遗传因素及环境条件等均有关系[2]。近年来肺炎支原体MP感染宿主后与其免疫系统的相互作用已越来越受到重视。
本研究通过检测MPP患儿血清中IL-6、IL-10及IFN-γ等3个在炎症反应中较为重要的细胞因子的水平，进一步明确各因子在MPP发病中的作用，以及从分子水平寻找影响病情轻重的免疫学指标。同时探讨IL-6与CRP的相关性，进一步明确在肺炎支原体肺炎中，作为急性实相反应蛋白的CRP所发挥的炎症介质的作用。指导临床治疗,以期改善预后,减少并发症及后遗症。
二．国内外关于本研究的现状及自己的见解
MP感染的致病机制尚未十分明确，基本倾向于呼吸道上皮细胞吸附学说、免疫学发病机制和支原体直接侵入学说[3]。MP可激活免疫系统，产生多种细胞因子和其他体液因子，保护机体抵抗侵袭，但过量产生的细胞因子反而对机体有害，可致病理反应[4]。细胞因子是泛指一些由机体免疫或非免疫细胞产生的与造血、炎症和免疫应答反应密切相关的小分子多肽糖蛋白。
在国外，自1962年Phillips[5]等人成功地用人工培养法获得肺炎支原体后，国内外医务工作者对其进行了大量研究。10多年来，随着认识及检测方法技术的不断发展，人们发现MP是引起小儿小呼吸道感染的重要病因之一。Phillips[6]等人1998年对8千余名15岁以下儿童进行调查发现，MPP占总肺炎发病率22%，仅次于链球菌肺炎发病率，占非典型肺炎首位，同时，小儿下呼吸道MP感染还呈现出发病年龄提前，肺外并发症多样等特点，更成为研究者们关注的特点。尤其是在免疫学方面，进行了大量研究工作。研究显示[7]，MP可借助特有的粘附结构紧密牢固的吸附与宿主细胞表面，逃避黏膜纤毛的清除作用及吞噬细胞的吞噬；MP对T淋巴细胞、B淋巴细胞起到分裂原的作用，并通过细胞因子，及直接作用于巨噬细胞、胶原细胞等，介导广泛的免疫反应。通过激活抗自身T淋巴细胞及使B淋巴细胞多克隆化，而发生自身免疫性疾病。另外，动物实验表明[8]，MP感染机体后不久，支气管分泌物中的补体成分C1，C2，C3，C4可呈1.6—942倍不等的升高，而这时组织并未发生病理变化，抗体水平正常。2周后，当补体水平下降时，抗体水平上升，提示MP感染初期补体发挥了非特异性保护作用。一般认为细胞免疫由MP细胞膜上的蛋白抗原引起。
而机体行使体液免疫[9]时，各种免疫球蛋白，免疫复合物发挥着不同作用。MP感染7天后，对绵羊红细胞抗体反应减弱，7-14天吞噬细胞功能降低。MP患儿可有低球蛋白血症，中性粒细胞趋化性降低，对植物血凝素反应下降，且对其它病原抵抗力明显降低。MP感染常呈可继续性发病，提示MP有免疫抑制作用。
临床流行病学发现[10]，MP感染在10岁以上小儿呈发病高峰，而小年龄儿则多可表现为无症状或轻症状。动物实验表明，MP初感染后大约在10至14天时发生组织病理反应，而再次感染的组织病理改变则可发生于最初3天之内，提示MP感染后机体产生免疫蓄积，对再次感染发生更为强烈的免疫反应。
国内外现已有MP感染后并发血液、心脏、肾脏、关节、皮肤、中枢神经系统等多器官系统损伤的报道，但就其发生的机理尚无统一的认识。有些学者在对MP感染后中枢神经系统受累患者的研究中找到了MP直接侵犯与免疫介导损伤同时存在，且毒素繁殖、宿主免疫改变均发挥了一定作用。最后的定论还有待与进一步科学证实。
个人认为，MP感染是小儿下呼吸道感染的一个不可忽视的问题。以往的研究充分说明，免疫机制在MP发病及肺外并发症发生过程中发挥着重要作用，但仍有许多问题摆在大家面前，如更为快速简便的确诊方法、肺外并发症发生的确切机理等，仍需要大量的科学工作去发现和解决。免疫学方法仍是值得关注的一环。本论文是在实习期间收集大量临床资料，对支原体肺炎患儿急性期血清中IL-6，IL-10，γ–IFN和CRP变化做了具体的分析，希望能对MP感染的研究有一定帮助。
主要研究内容：
1.设计内容
（1）支原体肺炎急性感染样本的确诊：选择采用咽拭子收集病人标本，检测标本中是否存在肺炎支原体的核酸，结合临床症状，确诊为肺炎支原体肺炎急性感染的样本。
（2）检测MP感染病人心肌酶谱有无改变。
（3）检测样本血清中白介素-6（IL-6），白介素-10（IL-10），γ-干扰素（IFN-γ）和C-反应蛋白(CRP)，结合病人心肌酶谱的情况，分析心肌酶谱正常组与不正常组及组间差异。
2.拟采取的主要研究方法
采取50例左右MPP急性期患儿和30例左右同期健康儿童空腹外周血血清作为标本，利用荧光定量PCR方法检测标本的核酸DNA。利用ELISA方法检测IL-6、IL-10、IFN-γ的浓度，并利用全自动生化分析仪检测标本中CRP的浓度。另外利用相关软件对IL-6与CRP的相关性进行分析。
设计方案：
选定题材→积极选择研究对象→保留实验血清→进行IL-6，IL-10，IFN-γ和CRP的浓度的检测→收集实验相关数据→撰写论文
1.材料与方法
1.1试剂
肺炎支原体核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒(Taq酶，反转录酶，RNA酶等)由广州达安基因公司生产，人白介素-6检测试剂盒(IL-6)、人白介素-10检测试剂盒(IL-10)、γ-干扰素检测试剂盒(IFN-γ)由法国DIACLONE深圳赛尔分装公司生产，超敏C反应蛋白检测试剂盒(Hs-CRP)由西班牙BioSystems公司生产，谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同功酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)由日本Olympus公司生产。
1.2仪器
电热恒温水温箱由北京长安科学仪器厂生产，KBH-360酶标仪由上海科华生产、KBH-36W自动洗板机，日本OlympusAU640生化分析仪，涡旋混匀器由姜堰市康健医疗器具厂生产，各种量程加样器由芬兰Biohit公司生产，40C型医用低速离心机由白洋离心机厂生产，TGL-16B离心机由上海安亭生产，DA7600荧光实时定量扩增仪由广州达安生产，K30B数显干式恒温器由杭州奥盛生产。
1.3实验方法
1.3.1 实验对象
1.实验组
选自成武县人民医院2010年6月至2011年4月确诊的支原体肺炎患儿47例，年龄1～6岁，平均3.7岁。其中男30例，女17例。MPP患儿全部病例均符合《诸福棠实用儿科学》第7版[6]中有关小儿肺炎支原体肺炎的诊断标准：(1)发热热型不定，热程1-3周；(2)刺激性干咳,有的酷似百日咳，有的伴胸痛、胸闷；(3)婴幼儿肺部体征明显，哮鸣音突出，年长儿肺部体征不明显；(4)青霉素、头孢及β内酰酶类药物对其诊治无效；(5)肺部X线摄片发现肺门阴影增浓、支气管肺炎改变、间质性肺炎改变，均一的实变影；(6)肺炎支原体抗体IgM阳性。本实验病例为筛查MP-IgM阳性后再做咽拭子荧光实时定量PCR检测肺炎支原体核酸阳性，且发病在7天内，均为急性期病例。
2.对照组
选自成武县人民医院28名与实验组同期体检的健康儿童。男18例，女10例，年龄2～6岁。
1.3.2 标本采集
1.血标本
采集实验对象清晨空腹的静脉血1 ml，2000 rpm离心5min，取血清500～600 μl装于清洁dose管中，编号，-70℃保存备用。
2.咽拭子标本
用咽拭子取咽后壁、扁桃体、假膜边缘或口腔溃疡处分泌物，将粘附分泌物的咽拭子置入无菌玻璃管，密封，-20℃保存待测。
1.3.3样本DNA的提取
(1)向咽拭子玻璃管中加入1 ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干带有标本的咽拭子；(2)吸取全部液体转至1.5 ml离心管中，12 000rpm离心5min；(3)去上清，沉淀中加如50 μlDNA提取液并用漩涡振荡器充分混匀，100℃恒温处理10min；(4)12 000rpm离心5min，取上清备用。
1.3.4荧光定量PCR检测肺炎支原体（MP）
1.阴性质控品处理：取出阴性质控品，复室温后，8000 rpm离心数秒，吸50 μl DNA抽取液充分混匀，100℃恒温处理10min，12 000rpm离心5min，取沉淀备用。
2.MP临界阳性质控品处理(同阴性质控品)
3.MP强阳性质控品处理(同阴性质控品)
4.MP阳性标准品处理：取出MP阳性标准品，复室温后，8000 rpm离心数秒，取沉淀备用。
5.加样: ①取处理后的样品(包括标本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品)上清液2 μl以及阳性定量参考品2 μl，分别加入已加有Mg2+、MP基因的引物、TaqDNA聚合酶等PCR反应体系的PCR反应管中，8000 rpm离心数秒，放入仪器样品槽。②编辑:打开软件系统，点击“增加新实验”，选择实验项目“肺炎支原体”，分别输入标本、阴性质控、弱阳性质控和标准品的数量以及在扩增仪中对应位置。设置循环条件：
93℃变性2min
93℃变性45s，55℃退火60s ,72℃延伸5min，10个循环
93℃变性30s，55℃退火45s，30个循环
荧光采集点在55℃45s。
(7)结果分析: ①反应结束后自动保存检测数据文件，根据分析后图像调节基线，使标准曲线图达到最佳，即r数值介于-1.0~-0.97。②选择“自动分析”来分析结果。记录仪器自动分析计算出的未知标本MP-DNA的浓度。
(8)质量控制
阴性质控品：增长的曲线不呈S型或Ct值＝30
阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在1×106基因拷贝/ml~2.0×107基因拷贝/ml范围，临界阳性质控品定量参考值在2×102基因拷贝/ml~2.0×104基因拷贝/ml范围。
阳性定量参考品：增长曲线呈S型曲线，Ct值<27，且0.97≤│r│≤1；
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
1.3.5 人白介素-6的检测
采用双抗体夹心法测定标本中人白介素-6(IL-6)水平。用纯化得IL-6抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入IL-6，再与HRP标记的IL-6抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在稀释后的辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-6呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度OD值，通过标准曲线计算样品中人IL-6浓度。
检测流程如下：
(1)使用前，将蒸馏水、稀释10倍的标准品、稀释后的生物素标记抗IL-6抗体、稀释后的HRP，标准品稀释液充分混合，不要使液体产生泡沫。(2)根据样品数量加上空白，标准品和质控决定所需的板条，标准品，空白做双份。(3)标记酶标板各孔为A1,A2,B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2,吸取200 μl标准品稀释液到酶标包被板A1,A2孔，并吸取100 μl到B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2孔(见下表)。从A1, A2孔吸取100 μl到B1,B2孔，用加样器反复吸排使其混合。小心不要擦到孔的内表面。同样从B1，B2孔吸取100 μl到C1,C2，再从C1,C2到D1,D2等，从最后的两个孔F1,F2中吸去100 μl不要。这样从A1,A2到F1,F2，IL-6标准品稀释液的浓度为200 pg/ml到6.25 pg/ml。(4)将100 μl标准品稀释液加入空白对照孔G1,G2, 100 μl样品入样品。(5)准备生物素标记抗IL-6，各孔加入50 μl稀释的生物素标记抗IL-6。(6)盖上板盖，室温下孵育1h，然后吸去孔中的液体。(7)设定洗板机程序洗板，加入0.3 ml洗涤液。浸泡1min后吸去洗涤液。重复此过程2次。(8)准备亲和素-HRP，每孔中加入100 μl亲和素-HRP。(9)盖上板盖，室温下孵育20min。然后吸去孔中的液体。同步骤7洗板。(10)每孔加入100 μl TMB底物液，室温下黑暗中孵育15min。用铝箔包住反应板，避免光照。迅速加入100 μl H2SO4完全，均一地终止反应。加入H2SO4后立即测定结果。(11)在酶标仪中读取结果。450 nm作为初始波长，620 nm作为参考波长。
1.3.6 人白介素-10的检测
采用双抗体夹心法测定标本中IL-10水平。用纯化的人IL-10抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入IL-10，再与HRP标记的IL-10抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-10呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度OD值，通过标准曲线计算样品中人IL-10浓度。
检测流程如下：
(1)使用前将稀释10倍的蒸馏水、标准品、稀释后的生物素标记抗IL-6、稀释后的HRP，洗涤缓冲液(100x)充分混合，不要使液体产生泡沫。根据样品数量加上空白，标准品和质控决定所需的板条，标准品，空白做双份。(2)标记酶标板各孔为A1,A2,B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2,吸取200 μl标准品稀释液到A1,A2孔，并吸取100 μl到B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2孔(见下表)。从A1,A2孔吸取100 μl到B1,B2孔，用加样器反复吸排使其混合。小心不要擦到孔的内表面。同样从B1,B2孔吸取100 μl到C1,C2，再从C1,C2到D1,D2等，从最后的两个孔F1,F2中吸去100 μl不要。这样从A1,A2到F1,F2，IL-10标准品稀释液的浓度为400 pg/ml到6.25 pg/ml。也可在试管中进行此稀释，将稀释后的标准品直接加入反应孔中。(3)加100 μl标准品稀释液入空白对照孔G1,G2, 100 μl样品入样品孔。(4)将各孔加入50 μl稀释的生物素标记抗IL-10，盖上板盖，室温下孵育2h，然后吸去孔中的液体。(5)设定洗板机程序洗板，加入0.3 ml洗涤液，浸泡1min后吸去洗涤液。重复此过程2次。(6)准备亲和素-HRP，每孔中加入100 μl亲和素-HRP，盖上板盖，室温下孵育20min。吸去孔中的液体。根据步骤5洗板。(7)每孔加入100 μlTMB底物液，室温下黑暗中孵育15min。用铝箔包住反应板，避免光照。(8)迅速加入100 μl H2SO4完全，均一地终止反应。加入H2SO4后立即测定结果。在酶标仪中读取结果。450nm作为初始波长，620nm作为参考波长。
1.3.7 γ-干扰素的检测
本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。将标准品、待测样本加入到预先包被IFN-γ单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，TMB在HRP催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中IFN-γ浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中IFN-γ含量。
检测流程如下：
(1)使用前将稀释10倍的蒸馏水、标准品、稀释后的生物素标记抗γ-干扰素、稀释后的HRP，洗涤缓冲液(100x)充分混合，不要使液体产生泡沫。根据样品数量加上空白，标准品和质控决定所需的板条，标准品，空白做双份。(2)标记酶标板各孔为A1,A2,B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2,吸取200 μl标准品稀释液到A1,A2孔，并吸取100 μl到B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2孔（见下表）。从A1,A2孔吸取100 μl到B1,B2孔，用加样器反复吸排使其混合。小心不要擦到孔的内表面。同样从B1,B2孔吸取100 μl到C1,C2，再从C1,C2到D1,D2等，从最后的两个孔F1,F2中吸去100 μl不要。这样从A1,A2到F1,F2，IFN-γ标准品稀释液的浓度为400 pg/ml到12.5 pg/ml。也可在试管中进行此稀释，将稀释后的标准品直接加入反应孔中。(3)加100 μl标准品稀释液入空白对照孔G1,G2, 100 μl样品入样品孔。(4)准备生物素标记抗IFN-γ,各孔加入50 μl稀释的生物素标记抗IFN-γ。盖上板盖，室温下孵育2h，然后吸去孔中的液体。(5)设定洗板机程序洗板，加入0.3 ml洗涤液，浸泡1min后吸去洗涤液。重复此过程2次。(6)准备亲和素-HRP，每孔中加入100 μl亲和素-HRP。盖上板盖，室温下孵育20min，然后吸去孔中的液体。同步骤5洗板。(7)每孔加入100 μlTMB底物液，室温下黑暗中孵育15min。用铝箔包住反应板，避免光照。(8)迅速加入100 μl H２SO４完全，均一地终止反应。加入H２SO４后立即测定结果。(9)在酶标仪中读取结果。450nm作为初始波长，620nm作为参考。
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